Historia synagogi w Żółkwi bierze swój początek od 1600 roku. Pierwsza drewniana synagoga znajdowała się na miejscu obecnej synagogi. W ciągu następnych dziesięcioleci nowi właściciele Żółkwi niejednokrotnie udzielali zgody na budowę murowanej synagogi, jednak do budowy doszło dopiero w 1687 roku, kiedy to drewniana synagoga spłonęła w wyniku kolejnego pożaru miasta. Wtedy już król Jan III Sobieski podarował wspólnocie żydowskiej kamień z kamieniołomów królewskich oraz pożyczył 800 złotych.  
Budowa synagogi przebiegała w latach 1692-1700. Brał w niej udział królewski architekt Piotr Beber. Ten fakt, że synagoga położona była obok murów obronnych miasta i bramy miejskiej spowodowała jej charakter obronny.  
Wnętrza sali modlitewnej zdobi fryz arkadowy złożony z 12 niewielkich półkulistych arkadek na każdej ze ścian oraz oryginalna polichromia i napisy z Pisma Świętego. Na ścianie wschodniej zachowały się dekoracje sztukatorskie niszy ołtarzowej.  
W czasie drugiej wojny światowej, w czerwcu 1941 roku wojska niemieckie zburzyły synagogę, w wyniku czego zniszczono stropy i wnętrze świątyni. W latach 1955-1956 synagoga częściowo została odnowiona. 
Synagoga należy do szeregu największych synagog w Europie, uważana jest ona za jedną z najpiękniejszych żydowskich świątyń renesansowych i jest wybitnym zabytkiem budownictwa obronnego z XVII wieku. W 1999 roku synagoga w Żółkwi została wpisana na listę 100 zagrożonych zabytków świata (program World Monuments Fund, Nowy Jork).